ELISA試驗中的注意事項
酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是獸醫疫病監測與防控中經常使用的一種試驗方法。因其較高的靈敏性和特異性，以及適于批量操作等優點，廣泛被應用于抗體或抗原的檢測中。但是該試驗對試驗操作要求較高，一些細節操作不當會對試驗結果造成很大偏差。本文就ELISA試驗中包注意的一些細節進行探討，
1 樣品的采集和保存
ELISA 試驗常用的是血清樣品，為了保證試驗的準確性，血清的采售和保存尤為重要。先應避免溶血，因為血紅蛋白中的類過氧化物活性物質會與試驗過程中的辣根過氧化物酶反應，造成假陽性的發生。其次，樣品采集過程中應盡量保證無菌操作，減少污染。為了保證樣品的有效物質不被降解，同時避免樣品發生腐敗，采集的樣品于 4℃短期保存。如需長期保存。則應-20℃*或-70℃保存，并避免反復凍融。
2 試劑的準備
目有很多商品化的ELISA 試劑盒可供選擇，省去了很多試劑的準備工作。但是商品化的試劑盒在使用也有很多注意事項。先，ELISA試驗對室溫的要求一般為18~26℃。有的反應步驟要求37℃恒溫。因此，實驗室先得滿足實驗條件，具備溫控系統和恒溫箱。在試驗了4℃保存的試劑盒必須恢復至18~26℃后方可使用，應注意每種試劑是否符合實驗要求，如檢查 TMD底物是否已經顯色變質。對不符合試驗要求的試劑棄用。嚴禁用于后續試驗。
3溫育反應時間的控制
因為ELISA是根據抗原抗體的特異性反應，依據酶標結合物和底物的顯色差異來進行試驗判斷，而酶促反應對反應時間又有很高要求，因而ELISA試驗中應嚴格按照說明書進行操作�？s短或延長反應時間，會造成試驗失敗和準確性降低。
4 洗板
為了確保ELISA測定的特異性，洗板可清除非特異性結合物質，減少背景信號，增加分析的信噪比。在洗板過程中，應注意避免液體濺出或者加液過程造成的反應孔交叉污染，同時在洗板結束后對板子進行拍干，并用洗耳球吹去反應孔底部的氣泡。洗板與下一步的加液過程不應間隔過長時間，否則會造成反應孔底部包被結合物變干，每一步孵育過程均應對反應板加蓋封口膜，以防液體揮發。
自備物品
1. 酶標儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
試劑盒組成
名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
微孔酶標板 | 12孔×8條 | 12孔×4條 | 無 |
標準品 | 0.3mL*6管 | 0.3mL*6管 | 無 |
樣本稀釋液 | 6mL | 3mL | 無 |
檢測抗體-HRP | 10mL | 5mL | 無 |
20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說明書進行稀釋 |
底物A | 6mL | 3mL | 無 |
底物B | 6mL | 3mL | 無 |
終止液 | 6mL | 3mL | 無 |
封板膜 | 2張 | 2張 | 無 |
說明書 | 1份 | 1份 | 無 |
自封袋 | 1個 | 1個 | 無 |
注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0、1.5、3、6、12、24 U/mL
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